我们本专题的目的在于介绍《中国药典》（年版）有关中药中真菌毒素检测的样品处理及仪器测定的整体解决方案，以期帮助广大网友选购合适的耗材及设备。

前言

年7月2日，国家药品监督管理局、国家卫生健康委发布公告，正式颁布年版《中华人民共和国药典》，此版药典将于今年12月30日起正式实施。

新版中国药典中药中真菌毒素检测变化详解

在中药安全性控制方面，新版药典要求有效控制外源性污染物的影响，并有效控制内源性有毒成分对中药安全性产生的影响。在真菌毒素测定方面，相较于年版《中国药典》，年版《中国药典》作了较大变化。主要包括以下6方面：

①通则的名称由原来的“黄曲霉毒素测定法”变更为“真菌毒素测定法；

②通则可测定的真菌毒素种类不仅限于黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)4种，还新增了赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、展青毒素、伏马毒素(B1、B2)及T-2毒素等7种。

③通则新增酶联免疫法用于黄曲霉毒素快速筛查。

④通则供试品制备方法分类细化。相较于版药典笼统的前处理方法，新版药典按照真菌毒素种类，分别制定了5种相应的供试品前处理方法及净化步骤，而在第六法多种真菌毒素液质法中，使用统一的通用前处理方法。新版药典与年版药典有关真菌毒素测定方法的对比如下表所示：

⑤通则增订方法检出限和定量限。增订了采用液相或液质方法时，每种真菌毒素需要达到的具体检出限和定量限，需要注意的是，《第六法多种真菌毒素测定法》因为采用了统一的前处理方法，故检出限与定量限和前五法不同（详见下表）。

⑥一部涉及真菌毒素检测的品种扩大至25种。

黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2

药材和饮片(新增5种，共24种)：远志、大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟榔、酸枣仁、薏苡仁、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣、僵蚕、土鳖虫、九香虫、马钱子、延胡索（元胡）、蜂房。

玉米赤霉烯酮

药材和饮片(新增1种，共1种)：薏苡仁。

中药中真菌毒素检测方案

新版药典《通则真菌毒素测定法》包括酶联免疫测定法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法三类分析方法。其中，酶联免疫测定法属于快速检测方法，适用于大批样品集中检测；液相色谱法简便易重现，配备的荧光检测器灵敏度高，适应微量检测要求，定量准确；液相色谱-串联质谱法灵敏度高，抗干扰强，定性更可靠，可以实现多成分同时检测，解决色谱分离不完全及假阳性的情况。本文将对这三类方法分别进行介绍。

1酶联免疫法

1.1供试品处理

1.1.1振荡提取

振荡提取是传统的样品提取方法。它是利用机械振荡使萃取剂与待测样品充分接触，达到目标化合物与基质分离、进入液相的提取目的,可在常温下进行。通常采用人工振摇和振荡器振荡两种方式实现。在《中国药典》年版通则真菌毒素测定法黄曲霉毒

素测定法的第三法（酶联免疫法）采用的是振荡器振荡。

1.2.2氮吹浓缩

氮吹浓缩通常是指将氮气吹入加热样品的表面进行样品浓缩，具有省时、操作方便、容易控制等特点，可很快得到预期的结果，实现大量样品的快速浓缩。。而实现这一过程的装置称为氮气吹干仪，又被称为氮气浓缩装置、氮气吹扫仪,氮吹浓缩仪,样品浓缩仪，也可简称为氮吹仪、吹氮仪,浓缩仪。它具有以下优点：①一次可处理多个样品，在多因素、多水平的重复实验中优势更为明显；②实验操作简洁、灵活。可以不受约東地注册会计随时调节浓缩的进程；③实验中不需要操作者长时间的维护，节省人力；④旋转蒸发仪在溶剂沸騰时可能会造成样品的损失，而氮吹仪在浓缩时准确、灵敏可避免样品损失。

在《中国药典》年版通则真菌毒素测定法中，为了获得更高的灵敏度或者转换溶剂，均需浓缩这一步骤，而氮吹是最常用的浓缩方式之一。黄曲霉毒素测定法的第三法（酶联免疫法）的供试品处理过程就有多次使用氮吹浓缩。

1.2测定方法

1.2.1酶联免疫试剂盒

酶联免疫吸附试验（ELISA）是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

1.2.2酶标仪

酶标仪（MicroplateReader）即酶联免疫检测仪(又称微孔板检测器），是对酶联免疫检测（EIA）实验结果进行读取和分析的专业仪器，是酶联免疫吸附试验的专用仪器。可简单地分为半自动和全自动两大类，但其工作原理基本上都是一致的，酶联免疫反应通过偶联在抗原或抗体上的酶催化显色底物进行，反应结果以颜色显示，通过显色的深浅即吸光度值的大小就可以判断标本中待测抗体或抗原的浓度。其核心都是一个比色计,即用比色法来进行分析。测定一般要求测试液的最终体积在μL以下，用一般光电比色计无法完成测试，因此对酶标仪中的光电比色计有特殊要求。

2液相色谱法

液相色谱法较多应用于单一成分真菌毒素的分析或者同种类真菌毒素的多成分分析。

2.1供试品处理

对于中药中真菌毒素的提取，应采用快速、简单、高效的提取方式，比如振摇、超声以及高速匀浆等。

2.1.1高速匀浆提取

在《中国药典》年版通则真菌毒素测定法中，包括黄曲霉毒素测定法、赭曲霉毒素A测定法、玉米赤霉烯酮测定法、呕吐毒素测定法等四个方法的第一法（液相色谱法）均采用高速匀浆提取法对供试品中待测真菌毒素进行提取。

高速匀浆器是能实现有机和水，不相容的两种液体之间的高效分散和乳化的设备。它具有强度很高的粉碎效果、对各种动物、植物的组织均能起到匀浆和混合的作用，在不同的速度下，能破碎不同的细胞膜，尤其对各类纤维性较强的植物以及动物组织的小量内脏、肌肉等进行粉碎。几乎所有植物性或动物性样品的初始样品制备阶段都要用到匀浆提取的过程。一般对植物样品、食品、尤其是含水量较高的新鲜样品，如蔬菜、水果等使用时较为方便简单。根据基质和目标物性质的不同，一般使用的提取溶剂以极性溶剂居多，标准方法中以使用乙腈居多。

高速匀浆器配有大小不同的三把刀具、以便用户根据样品的多少，选用不同的三把刀具，小刀可对3毫升的微量样品进行匀浆、也可对mL~mL的样品进行破碎。采用电子控制高速电机，带动不锈钢内外梅花型粉碎刀、对各种物质高速匀浆和破碎和乳化。高速匀浆器连续使用两分钟必须停止，待冷却后方可再使用。

2.1.2离心分离

中药材等固体样品经溶剂提取后，形成了固液体系。因此，还有一个重要前处理步骤，就是实现固液分离。实现这个步骤可以用过滤（抽滤）和离心等操作进行。过滤可以用简单的滤纸进行，也可以用助滤剂（如Celite）进行抽滤。如果使用离心分离时，应注意防止容器的破碎。在《中国药典》年版通则真菌毒素测定法中，主要采用的是离心分离法。同时，为了避免液体转移产生的损失，保证定量准确，一般都是直接从离心后的中准确移取部分液体用于后续的操作。

离心机是利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的机械。离心机主要用于将悬浮液中的固体颗粒与液体分开，或将乳浊液中两种密度不同，又互不相溶的液体分开（例如从牛奶中分离出奶油）；它也可用于排除湿固体中的液体，特殊的超速管式分离机还可分离不同密度的气体混合物；利用不同密度或粒度的固体颗粒在液体中沉降速度不同的特点，有的沉降离心机还可对固体颗粒按密度或粒度进行分级。

2.1.3免疫亲和柱净化

免疫亲和柱的全称为免疫亲和层析柱（简称为亲和柱、免疫亲和柱、亲和层析柱等），它是利用抗原抗体特异性可逆结合特性的SPE技术,根据抗原抗体的高选择性，从复杂的待测样品中提取目标化合物。

免疫亲和净化的原理是将抗体与惰性微珠共价结合，然后装柱，将抗原溶液过免疫亲和柱，而非目标化合物则沿柱流下，后用洗脱缓冲液洗脱抗原,从而得到纯化的抗原。

因为免疫亲和柱的高特异性，使用免疫亲和柱净化可以获得纯净的样品提取物，如同标准品般纯净的提取物可以用相对简单常见的检测方式获得准确的定量检测结果，这对于微量甚至痕量分析很重要。在样品净化过程中，使用亲和柱同时避免了常规液液萃取中大量有机溶剂的使用，加强了对实验员的保护。

《中国药典》年版通则真菌毒素测定法采用了免疫亲和柱法作为净化手段。

2.2仪器测定

2.2.1液相色谱柱

色谱作为一种分离技术与方法，自本世纪初起已经有多年的历史了。液相色谱柱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，色谱柱的选择会直接影响混合物中组分的分离。

最常用的液相色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对应异构体的分离通常使用手性填充剂。

在《中国药典》年版通则真菌毒素测定法中，所使用到的液相色谱柱填充剂类型均为十八烷基硅烷键合硅胶。

2.2.2液相色谱仪

液相色谱法是一种经典的色谱分析方法，它的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。高效液相色谱仪由输出泵、进样装置、色谱柱、梯度冲洗装置、检测器及数据处理和微机控制单元组成。检测器的功能是将从色谱柱中流出的已经分离的组分显示出来或转换为相应的电信号，主要有紫外吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器和折光示差检测器，其中以紫外吸收检测器使用最广，几乎成为液相色谱仪的标配检测器。在《中国药典》（年版）通则真菌毒素测定法中，呕吐毒素测定法的第一法（液相色谱法）也采用了紫外检测器。

而配有荧光检测器的高效液相色谱仪具有更高选择性(只对荧光物质有响应）、更高灵敏度（最低检出限可达10-12ug/ml），特别适合于灵敏度要求极高的痕量分析，如真菌毒素测定。因此，在《中国药典》（年版）通则真菌毒素测定法中，包括黄曲霉毒素测定法、赭曲霉毒素A测定法、玉米赤霉烯酮测定法等三个方法的第一法（液相色谱法）的检测器均为荧光检测器。除了黄曲霉毒素的测定需要采用柱后衍生外，赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮都无需衍生即可直接测定。

3液相色谱-串联质谱法

当采用第一法（液相色谱法）或第三法（酶联免疫法）测试，出现基质干扰或含量较低难以采用液相色谱法准确测定时，应采用液相色谱-串联质谱法测定，该方法还可用于不同种类的真菌毒素同时测定，实现真菌毒素的高通量快速筛选及含量测定。

3.1供试品处理

在《中国药典》（年版）通则真菌毒素测定法中，黄曲霉毒素测定法、赭曲霉毒素A测定法、玉米赤霉烯酮测定法和呕吐霉素测定法等四个方法的第二法（液相色谱-串联质谱法）的供试品溶液制备均同第一法（液相色谱法），在前文已经做了介绍。而展青霉素测定法和多种真菌毒素测定法只用到了液相色谱-串联质谱法，本节主要介绍的是这两个方法的供试品处理。

3.1.1匀质提取

对于中药中展青霉素的提取，《中国药典》（年版）通则真菌毒素测定法采用的是高速匀浆提取，这与液相色谱法测定其他真菌毒素的提取方式是相似的。不同之处在于，本法需要事先特别加入果胶酶在40℃下酶解2小时。

3.1.2超声提取

针对中药中多种真菌毒素的提取，《中国药典》年版通则真菌毒素测定法采用的是超声波提取法。

超声波辅助提取是近几年发展起来的一种提取技术，它利用超声波辐射压强产生的强烈空化应效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取进行的成熟萃取技术。在使用超声提取法时，若使用乙醚，正戊烷等沸点较低的挥发性溶剂，连续超声提取会使得水槽温度上升，导致溶剂沸腾甚至冲盖，影响最后测定结果。因此可在水槽中加入适量冰袋，维持温度在一个适度较低的状态。

超声提取法具有明显的优势：多次总萃取效率高，可以提取完全；反应条件温和，不对目标化合物造成破坏。其缺点是：单次提取效率一般，须进行多次操作，较为繁琐；萃取溶剂需求量大，后续需要浓缩。

3.1.3固相萃取净化

不同于前面4种液相色谱法的供试品溶液制备的净化方法，展青霉素测定法和多种真菌毒素测定法的净化柱均为普通固相萃取柱，而不是免疫亲和柱。其中展青霉素测定法采用通过式固相萃取技术，而多种真菌毒素测定法采取保留式固相萃取技术。

固相萃取（Solid-phaseextraction，SPE）是现代前处理萃取技术，是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术，由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。其基本原理是利用固体吸附剂将液体待测样品中的目标化合物吸附，与待测样品的基质和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的效果。该方法主要用于样品的分离，纯化和富集，其目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。

3.2液相色谱-串联质谱仪测定

液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS），以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质荷比分开，经检测器得到质谱图。作为一种新的现代技术分析手段，LC-MS/MS技术在分离效能、灵敏度和专属性等方面都有着巨大的优势，展现出强大的定性、定量分析能力，从而得到广泛的运用。

在《中国药典》年版通则真毒毒素测定法中，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法被广泛采用，6个检测方法均采用了LC-MS/MS法，且将该法作为定性确证方法。中明确规定，各方法中如果采用第一法（液相色谱法）的测定结果超出限度时，均采用收载的第二法该法进行确认。